题目内容
【题目】回答下列（一）、（二）小题：
（一）苹果可以制作成苹果汁、苹果酒和苹果醋等多种产品，深受大众喜爱。
（1）在榨取苹果汁时，往往添加适量的黑曲霉提取液，其中含有的_________可水解果胶，从而使果汁澄清。在纯化所需黑曲霉时，采用平板划线法接种培养一段时间后，发现第一划线区域上都不间断长满菌落，第二划线区域几乎无菌落，此现象出现的原因可能是_______________。纯化得到的菌种可用划线法接种于_______，培养一定时间后保存。
（2）制备好的的苹果汁可用于制作苹果酒。发酵一定时间后，观察到发酵罐内液面_______，说明发酵基本完毕。果酒酿造过程中，即使含有醋杆菌，在酒精发酵旺盛时，醋杆菌不能将果汁中的糖发酵为醋，理由是____________。
（3）苹果酒可用于制备苹果醋，在制备果醋时使用了优良菌种，且流入发酵罐的苹果酒质量很好，但是生产的苹果醋产量和质量不够高，排除温度和 PH 以外的原因可能是 ____（写二点）。
（4）下列关于果酒、果醋制作的叙述，错误的是（____）
A． 制作果酒过程中，发酵罐放气的频率呈先升高后降低的趋势
B． 控制好温度和酸碱度既有利于目的菌的繁殖，又可抑制杂菌的生长
C． 制作果酒和果醋的微生物呼吸类型不完全相同
D． 发酵过程中所有材料都需要进行严格的灭菌处理，以免杂菌污染
（二）如图所示为质粒B和一个含目的基因的DNA片段示意图。图中Ap为氨苄青霉素抗性基因，lacZ为蓝色显色基因（能使含该基因的大肠杆菌菌落呈蓝色）。图中EcoRⅠ、PvuⅠ为两种限制酶，括号内的数字表示限制酶切割位点与复制原点的距离。请据图分析并回答问题：
（1）外源基因在受体细胞中能启动表达的关键是载体上具有_________识别和结合的部位。
（2）将用限制酶_____切开的质粒B溶液与目的基因溶液混合，加入DNA连接酶连接后，导入大肠杆菌。为了便于筛选，作为受体细胞的大肠杆菌自身______（含/不含）lacZ基因和_____（有/没有）氨苄青霉素抗性。导入后应从_____________两个角度对受体细胞进行筛选。
（3）将获得的重组质粒用EcoRⅠ完全酶切并进行电泳观察，若出现长度为 3．1 kb 和____kb的片段，则载体和目的基因反向连接。若出现长度为_____kb 和___kb的片段，则载体和目的基因正向连接。（重组质粒上目的基因的插入位点与EcoRⅠ的识别位点之间的碱基对忽略不计）
【答案】果胶酶 接种环灼烧后未冷却就划线或未从第一区域末端开始划线 培养基 不再有气泡冒出 醋杆菌是好氧细菌，而果酒发酵为无氧环境，醋杆菌无法生存 醋杆菌数目较少，氧气量不够，流速控制不好，有杂菌侵入等 D RNA聚合酶 PvuⅠ 不含 没有 菌落的颜色和对氨苄青霉素的抗性 3.6 1.1 5.6
【解析】
1、微生物常见的接种的方法
①平板划线法：将已经熔化的培养基倒入培养皿制成平板，接种，划线，在恒温箱里培养。在线的开始部分，微生物往往连在一起生长，随着线的延伸，菌数逐渐减少，最后可能形成单个菌落。
②稀释涂布平板法：将待分离的菌液经过大量稀释后，均匀涂布在培养皿表面，经培养后可形成单个菌落。
2、分析题图：如图所示为质粒和一个含目的基因的DNA片段示意图。图中Ap为氨苄青霉素抗性基因，lacZ为蓝色显色基因。EcoRI（0.7Kb）、Pvu I（0.8Kb）等为限制酶及其切割的位点与复制原点的距离。
（一）（1）黑曲霉提取液中含有的果胶酶可水解果胶，从而使果汁澄清。采用平板划线法接种培养一段时间后，发现第一划线区域上都不间断地长满了菌落，第二划线区域上几乎无菌落，出现此现象的原因可能是接种环灼烧后未冷却就划线或未从第一区域末端开始划线。纯化得到的菌种可用划线法接种于适宜生长的固体培养基上，培养一定时间后保存。
（2）发酵一定时间后，观察到发酵罐内液面不再有气泡冒出，说明发酵基本完毕。醋杆菌是好氧细菌，而果酒发酵为无氧环境，醋杆菌无法生存，所以果酒酿造过程中，即使含有醋杆菌，在酒精发酵旺盛时，醋杆菌也不能将果汁中的糖发酵为醋。
（3）在制备果醋时使用了优良菌种，且流入发酵罐的苹果酒质量很好，但是生产的苹果醋产量和质量不够高，排除温度和pH以外的原因可能是醋杆菌数目较少，氧气量不够，流速控制不好，有杂菌侵入等。
（4）A、制作果酒过程中，产生二氧化碳速率先较快后减慢，故发酵罐放气的频率呈先升高后降低的趋势，A正确；
B、控制好温度和酸碱度既有利于目的菌的繁殖，又可抑制杂菌的生长，B正确；
C、制作果酒的酵母菌及进行有氧呼吸，又进行无氧呼吸，制作果醋的微生物只进行有氧呼吸，C正确；
D、传统发酵过程中只进行消毒处理，没有进行严格的灭菌处理，D错误。
故选D。
（二）（1）外源基因在受体细胞中能启动表达的关键是载体上具有启动子，即RNA聚合酶识别和结合的部位。
（2）据图可知，目的基因两端具有限制酶PvuⅠ的切点，故用限制酶PvuⅠ切开的质粒B溶液与目的基因溶液混合，加入DNA连接酶连接后可形成重组质粒，再导入受体细胞。为了便于筛选，作为受体细胞的大肠杆菌自身不含lacZ基因和没有氨苄青霉素抗性。导入后应从菌落的颜色和对氨苄青霉素的抗性两个角度对受体细胞进行筛选。
（3）析图可知，目的基因上存在着EcoRI酶的切割位点，构建重组质粒时使用Pvul，重组质粒长度为2.7+4=6.7kb，目的基因可正向或反向连接到质粒上。使用EcoRl切割之后进行电泳检测。若载体和目的基因正向连接，则电泳图谱中出现长度为1.1kb（0.8-0.7+1.0）和5.6kb[2.7-（0.8-0.7+（4.0-1.0）]，若载体和目的基因反向连接，则电泳图谱中出现长度为3.1kb[（0.8-0.7）+3.0]和3.6kb[2.7-（0.8-0.7）+1.0]的片段。
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