题目内容
【题目】新型冠状病毒是一种单链 RNA 病毒，新型冠状病毒感染的常规检测方法是通过实时荧光 PCR 鉴定。
（1）首先，从样本中提取病毒RNA，经_____酶作用生成cDNA。然后以cDNA为模板 进行实时荧光PCR扩增，测定样品中病毒核酸量。
（2）通过实时荧光PCR扩增目的基因，需额外添加荧光标记探针（一小段单链DNA，可与目的基因中部序列特异性结合）。当探针完整时，不产生荧光。在PCR过程中，与目的基因结合的探针被TaqDNA聚合酶水解，R与Q分离后，R发出的荧光可被检测到（如图 1）。
① 当样本中有目的基因时，引物和探针与目的基因退火，通过形成_____而特异性结合。
② 在 PCR 循环的_____阶段，TaqDNA 聚合酶催化子链的合成并水解探针。检测到的荧光强
（3）在通过实时荧光 PCR 检测新型冠状病毒感染时，检测到的荧光强度变化如图 2 所示。
① 与指数增长期相比，线性增长期目的基因数量的增长率下降，原因有_____。
② Ct 值的含义：在 PCR 扩增过程中，每个反应管内的荧光信号达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数。因此，当样本中初始模板越多时，Ct 值就_____。
③ 某新型冠状病毒核酸检测说明书标明，Ct≤37 判定为阳性，Ct>40 或无 Ct 值判定为阴性。图 2 所示新型冠状病毒核酸检测结果应判定为_____。
（4）阴性结果也不能排除新型冠状病毒感染。可能产生假阴性的因素有_____。
a．取样太早，样本中病毒量少，达不到实时荧光 PCR 检测阈值
b．样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解
c．病毒发生变异
【答案】逆转录 氢键 延伸 底物浓度下降、酶活性下降 越小 阳性 abc
【解析】
PCR一般要经历三十多次循环，每次循环可分为变性、复性、延伸三步，常需要进行一次预变性，以便增加大分子模板DNA彻底变性的概率。
（1）由病毒RNA生成cDNA的过程属于逆转录，需要逆转录酶的催化。
（2）① 当样本中有目的基因时，引物和探针与目的基因退火，通过碱基互补配对形成氢键而特异性结合。②在 PCR 循环的延伸阶段，TaqDNA 聚合酶催化子链的合成并水解探针。
（3）① 线性增长期目的基因数量的增长率下降，有可能是底物浓度降低导致的，也有可能是酶的活性缓慢下降导致的。② 样本中初始模板越多时，达到设定的荧光阈值时所经历的扩增循环数就越小，Ct 值就越低。③ 据图2可知荧光阈值大概是36，新型冠状病毒核酸检测结果应判定为阳性。
（4）阴性结果也不能排除新型冠状病毒感染。可能产生假阴性的因素有，取样太早，样本中病毒量少，达不到实时荧光 PCR 检测阈值，样本被污染，RNA酶将病毒RNA降解，病毒发生变异。
