[题目]先导编辑技术是利用经过改造的Cas9蛋白.在基因组中的特定位点切断DNA.随后逆转录酶在RNA链的引导下在切断处进行基因编辑.其能实现更精准地对DNA进行编辑.该过程流程如图所示.该技术可以实现基因的定点突变和整合.将修饰好的基因导入胚胎干细胞.治疗人类某些单基因遗传病.(1)基因重组技术工具中的酶与先导编辑工具� 题目和参考答案——青夏教育精英家教网—

题目内容

【题目】先导编辑技术是利用经过改造的Cas9蛋白，在基因组中的特定位点切断DNA，随后逆转录酶在RNA链的引导下在切断处进行基因编辑，其能实现更精准地对DNA进行编辑，该过程流程如图所示。该技术可以实现基因的定点突变和整合，将修饰好的基因导入胚胎干细胞，治疗人类某些单基因遗传病。

（1）基因重组技术工具中的_______酶与先导编辑工具中Cas9蛋白作用相似，但二者的不同之处是前者____________________________________________________________。

（2）下图为由经过修饰的pku基因构建的重组载体，在转化胚胎干细胞时，只有重组载体中整合区域正确整合到胚胎干细胞染色体DNA上才表示转化成功，而重组载体的其他区域将被靶向分解。在转化中会出现错误整合，整合错误才会出现重组载体中的两个HSV-tk中至少会有一个与neor一起整合到染色体DNA上而不被分解。已知含有标记基因neor的细胞具有G418的抗性。HSV-tkl、HSV-tk2的产物都能把DHPG转化成有毒物质而使细胞死亡。

①题干中的胚胎干细胞可以来自_____________________________，利用胚胎干细胞为受体细胞是因为其功能上具有________________________。

②胚胎干细胞在体外培养时需要满足的条件除一定的气体环境、充足营养、适宜的温度和PH外，还应保证____________条件，气体环境中的CO2的作用是_____________________。

③转化后的各类胚胎干细胞要依次在含有G418和____________________的培养液中培养，在双重选择下存活并增值的是正确整合的胚胎干细胞，原因是________________________________________。

【答案】限制酶（限制性核酸内切酶）识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中的特点部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开早期胚胎或原始性腺发育的全能性无菌、无毒环境维持培养液PH 同时含有G418和DHPG 能在含有G418的培养液存活说明转化后的胚胎干细胞中含neor，能在同时含G418和DHPG的培养液中存活说明转化后的胚胎干细胞中含neor且不含HSV-tk

【解析】

1、根据题意分析可知，CRISPR/Cas9系统基因编辑技术是利用该基因表达系统中的引导RNA能识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas9蛋白结合到相应位置并剪切DNA，最终实现对靶基因序列的编辑。由于其他DNA序列也含有与引导RNA互补配对的序列，造成引导RNA错误结合而出现脱靶现象。

2、基因工程技术的基本步骤：

（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。

（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。

（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。

（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。

3、DNA重组技术至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、运载体。构建重组载体时，首先需用限制性核酸内切酶切割目的基因和运载体，再用DNA连接酶连接目的基因和运载体形成重组载体。胚胎干细胞简称ES或EK细胞，来源于早期胚胎或原始性腺（即囊胚期的内细胞团），因此获取的胚胎干细胞应取自囊胚的内细胞团。

（1）基因重组技术工具中的限制酶与先导编辑工具中Cas9蛋白作用相似，但二者的不同之处是前者识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中的特点部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。

（2）①题干中的胚胎干细胞可以来自早期胚胎或原始性腺，利用胚胎干细胞为受体细胞是因为其功能上具有发育的全能性。

②胚胎干细胞在体外培养时需要满足的条件除一定的气体环境、充足营养、适宜的温度和pH外，还应保证无菌、无毒环境条件，气体环境中的CO2的作用是维持培养液pH。

③由题意可知，转化后的各类胚胎干细胞要依次在含有G418和同时含有G418和DHPG的培养液中培养，在双重选择下存活并增值的是正确整合的胚胎干细胞，原因是能在含有G418的培养液存活说明转化后的胚胎干细胞中含neor，能在同时含G418和DHPG的培养液中存活说明转化后的胚胎干细胞中含neor且不含HSV-tk。