题目内容
【题目】先导编辑技术是利用经过改造的Cas9蛋白，在基因组中的特定位点切断DNA，随后逆转录酶在RNA链的引导下在切断处进行基因编辑，其能实现更精准地对DNA进行编辑，该过程流程如图所示。该技术可以实现基因的定点突变和整合，将修饰好的基因导入胚胎干细胞，治疗人类某些单基因遗传病。
（1）基因重组技术工具中的_______酶与先导编辑工具中Cas9蛋白作用相似，但二者的不同之处是前者____________________________________________________________。
（2）下图为由经过修饰的pku基因构建的重组载体，在转化胚胎干细胞时，只有重组载体中整合区域正确整合到胚胎干细胞染色体DNA上才表示转化成功，而重组载体的其他区域将被靶向分解。在转化中会出现错误整合，整合错误才会出现重组载体中的两个HSV-tk中至少会有一个与neor一起整合到染色体DNA上而不被分解。已知含有标记基因neor的细胞具有G418的抗性。HSV-tkl、HSV-tk2的产物都能把DHPG转化成有毒物质而使细胞死亡。
①题干中的胚胎干细胞可以来自_____________________________，利用胚胎干细胞为受体细胞是因为其功能上具有________________________。
②胚胎干细胞在体外培养时需要满足的条件除一定的气体环境、充足营养、适宜的温度和PH外，还应保证____________条件，气体环境中的CO2的作用是_____________________。
③转化后的各类胚胎干细胞要依次在含有G418和____________________的培养液中培养，在双重选择下存活并增值的是正确整合的胚胎干细胞，原因是________________________________________。
【答案】限制酶（限制性核酸内切酶） 识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中的特点部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开 早期胚胎或原始性腺 发育的全能性 无菌、无毒环境 维持培养液PH 同时含有G418和DHPG 能在含有G418的培养液存活说明转化后的胚胎干细胞中含neor，能在同时含G418和DHPG的培养液中存活说明转化后的胚胎干细胞中含neor且不含HSV-tk
【解析】
1、根据题意分析可知，CRISPR/Cas9系统基因编辑技术是利用该基因表达系统中的引导RNA能识别并结合特定的DNA序列，从而引导Cas9蛋白结合到相应位置并剪切DNA，最终实现对靶基因序列的编辑。由于其他DNA序列也含有与引导RNA互补配对的序列，造成引导RNA错误结合而出现脱靶现象。
2、基因工程技术的基本步骤：
（1）目的基因的获取：方法有从基因文库中获取、利用PCR技术扩增和人工合成。
（2）基因表达载体的构建：是基因工程的核心步骤，基因表达载体包括目的基因、启动子、终止子和标记基因等。
（3）将目的基因导入受体细胞：根据受体细胞不同，导入的方法也不一样。将目的基因导入植物细胞的方法有农杆菌转化法、基因枪法和花粉管通道法；将目的基因导入动物细胞最有效的方法是显微注射法；将目的基因导入微生物细胞的方法是感受态细胞法。
（4）目的基因的检测与鉴定：分子水平上的检测：①检测转基因生物染色体的DNA是否插入目的基因--DNA分子杂交技术；②检测目的基因是否转录出了mRNA--分子杂交技术；③检测目的基因是否翻译成蛋白质--抗原-抗体杂交技术。个体水平上的鉴定：抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等。
3、DNA重组技术至少需要三种工具：限制性核酸内切酶（限制酶）、DNA连接酶、运载体。构建重组载体时，首先需用限制性核酸内切酶切割目的基因和运载体，再用DNA连接酶连接目的基因和运载体形成重组载体。胚胎干细胞简称ES或EK细胞，来源于早期胚胎或原始性腺（即囊胚期的内细胞团），因此获取的胚胎干细胞应取自囊胚的内细胞团。
（1）基因重组技术工具中的限制酶与先导编辑工具中Cas9蛋白作用相似，但二者的不同之处是前者识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且使每一条链中的特点部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。
（2）①题干中的胚胎干细胞可以来自早期胚胎或原始性腺，利用胚胎干细胞为受体细胞是因为其功能上具有发育的全能性。
②胚胎干细胞在体外培养时需要满足的条件除一定的气体环境、充足营养、适宜的温度和pH外，还应保证无菌、无毒环境条件，气体环境中的CO2的作用是维持培养液pH。
③由题意可知，转化后的各类胚胎干细胞要依次在含有G418和同时含有G418和DHPG的培养液中培养，在双重选择下存活并增值的是正确整合的胚胎干细胞，原因是能在含有G418的培养液存活说明转化后的胚胎干细胞中含neor，能在同时含G418和DHPG的培养液中存活说明转化后的胚胎干细胞中含neor且不含HSV-tk。
