题目内容
【题目】突尼斯软籽石榴是一种热门水果，深受大家喜爱，但其抗寒能力差，这成为限制该种石榴栽培的重要因素。科学家们利用基因工程对其进行定向改造，以得到抗寒性强的优良品种。下图表示构建基因表达载体的方法，图中标注的是限制酶的酶切位点，请回答下列问题：
（1）在切割目的基因时选择的两种限制酶最好为____________________，选择两种限制酶的优势是可避免________________。
（2）可通过________技术对获得的抗寒基因进行体外扩增，该过程使DNA解旋的方法与细胞内复制时的差异是________________，体外扩增时使用的酶具有的显著特点是__________________。
（3）将重组质粒导入经________（过程）培养成的软籽石榴的愈伤组织中常用________法。
【答案】SmaI和PstI 质粒自身成环和质粒与目的基因的反向连接 PCR 体外扩增目的基因利用加热至90~95℃的高温使DNA解旋，细胞内复制目的基因使用解旋酶使DNA解旋 耐高温（或具有热稳定性） 脱分化 农杆菌转化
【解析】
分析题图可知：HindIII的切割位点会破坏质粒的标记基因，AluI会破坏目的基因，故不能用上述两种酶切割。
（1）根据图中各种限制酶的切割位点，既可以获得目的基因又不能破坏质粒上的标记基因，故选用SmaI和PstI；选择两种酶的优势是可避免含有目的基因的外源DNA自身环化，可以防止质粒自身环化，也可避免质粒与目的基因的反向连接。
（2）对获得的抗寒基因进行体外扩增，可用PCR技术；在细胞内DNA复制需要解旋酶将双链解开，而PCR技术利用加热至90~95℃的高温使DNA解旋；该技术使用的DNA聚合酶具有耐高温的特性。
（3）软籽石榴的愈伤组织经过植物组织培养得过程中的脱分化环节得到；将重组质粒导入受体细胞常用农杆菌转化法。
