题目内容
【题目】科学家将人的生长激素基因与大肠杆菌的DNA分子进行重组，并成功地在大肠杆菌中得以表达。但在进行基因工程的操作过程中，需使用特定的限制酶切割目的基因和质粒，便于重组和筛选。已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是一G↓GATCC一，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是一↓GATC—，请据图回答：
（1）在构建基因表达载体的过程中，应用限制酶_______切割质粒，用限制酶________切割目的基因。用限制酶切割目的基因和载体后形成的黏性末端通过_________原则进行连接。
（2）在过程③中一般将受体大肠杆菌用__________进行处理，以增大___________的通透性，使含有目的基因的重组质粒容易进入受体细胞。
（3）将得到的大肠杆菌B涂布在一个含有氨苄青霉素的培养基上，得到如图a所示的结果（圆点表示菌落），该结果说明能够生长的大肠杆菌中已导入了__________，反之则没有导入；再将灭菌绒布按到培养基a上，使绒布表面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图b所示的结果(圆圈表示与图a中培养基上对照无菌落的位置）。与图b圆圈相对应的图a中的菌落表现型是__________，这些大肠杆菌中导入了______________________。
【答案】Ⅰ Ⅱ 碱基互补配对 CaCl2溶液 细胞壁 普通质粒或重组质粒 抗氨苄青霉素而不抗四环素 重组质粒
【解析】
已知限制酶Ⅰ的识别序列和切点是一G↓GATCC一，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是一↓GATC—，如果用限制酶Ⅱ切割质粒，两个标记基因都被破坏，所以上述质粒用限制酶Ⅰ切割；分析题图可知，要获取目的基因用限制酶Ⅱ切割。将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，还要加入适量的DNA连接酶。质粒上至少要有一个标记基因的理由是检测重组质粒(或目的基因)是否导入受体细胞。
（1）由题意可知，限制酶Ⅰ的识别序列和切点是一G↓GATCC一，限制酶Ⅱ的识别序列和切点是一↓GATC—，因此，限制性核酸内切酶Ⅰ能切割的位置限制性核酸内切酶Ⅱ也可以切割，限制性核酸内切酶Ⅰ和限制性核酸内切酶Ⅱ在质粒上的切割位点均位于标记基因上，为了保证质粒上至少保留一个标记基因，所以切割质粒时需用限制性核酸内切酶Ⅰ。目的基因两端的限制酶识别序列不同，由于限制性核酸内切酶Ⅰ能切割的位置限制性核酸内切酶Ⅱ也可以切割，所以切割目的基因可用限制性核酸内切酶Ⅱ。用限制酶切割目的基因和运载体后形成的黏性末端通过碱基互补配对原则进行连接。
（2）在过程③一般将受体大肠杆菌用CaCl2（Ca2+或钙离子）处理，以增大细胞壁的通透性，使含有目的基因的重组质粒容易进入受体细胞。
（3）由于基因表达载体上的标记基因是抗氨苄青霉素基因，将得到的大肠杆菌B涂布在一个含有氨苄青霉素的培养基上，能够生长的细菌中都含有抗氨苄青霉素基因，所以，大肠杆菌细胞中导入的可能是普通质粒，也可能是重组质粒；再将灭菌绒布按到培养基a上，使绒布表面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，分析得到的结果可知，图中b空圈无菌落形成，说明与之相对应的图a中的菌落应该是对四环素没有抗性，其表现型是抗氨苄青霉素但不抗四环素，可以确定这些菌体中导入的一定是重组质粒。
