Question

【题目】PCR扩增过程示意图如下，核心要素包括引物设计、温度控制和模板DNA的获得。请回答下列问题：

（1）欲构建抗利尿激素的cDNA文库，应从________(组织)中提取________，通过________获得cDNA用于PCR扩增。

（2）设计一对与抗利尿激素基因两端序列互补配对的引物时(引物1和引物2)，一般在引物的________端需要增加适当的限制酶切割位点，其目的是____________________________。

（3）PCR设计的引物序列一般介于20～30 bp，若引物序列太长带来的影响主要是______________________________________。

（4）PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度的设定主要与________________有关。

（5）如果模板DNA完全正常，但PCR反应得不到任何扩增产物，其原因可能为____________、____________。

Answer 1

【答案】下丘脑 总mRNA 逆转录 5′ 便于酶切后构建基因表达载体（重组质粒） PCR特异性提高，但是引物与模板链的结合效率降低 引物长度、碱基组成 退火温度太高 引物设计错误

【解析】

利用PCR技术扩增目的基因：PCR是多聚酶链式反应的缩写，原理：DNA双链复制；过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链（变性）；第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链（退火）；第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始进行互补链的合成（延伸）；扩增目的基因的前提：要有一段已知目的基因的核苷酸序列，以便根据这一序列合成引物。

（1）下丘脑分泌抗利尿激素，所以欲构建抗利尿激素的cDNA文库，应从下丘脑中提取总mRNA，通过逆转录等过程获得cDNA用于PCR扩增。这里提取mRNA是无法选择的，只能将所有mRNA均提取出来，在PCR时可以通过设计特异性的引物来达到PCR扩增某基因的目的。

（2）PCR是基因工程的第一步，为了后续构建基因表达载体，在设计一对与抗利尿激素基因两端序列互补配对的引物时（引物1和引物2），一般在引物的5′端需要增加适当的限制酶切割位点。

（3）PCR设计的引物序列一般介于20～30bp，若引物序列太长带来的影响主要是扩增效率降低，而引物太短又容易导致异常DNA的产生。

（4）PCR扩增时，退火温度的设定是成败的关键。退火温度的设定主要与引物长度和碱基组成中G-C比例呈正相关。

（5）如果退火温度太高，引物无法与模版链结合，所以如果模板DNA完全正常，但PCR反应得不到任何扩增产物，其原因可能为退火温度太高或引物设计错误（无法与任何模板链结合，无法进行DNA复制）