[题目]引起人类产生埃博拉出血热的埃博拉病毒(EBOV).是一种单链RNA病毒.某研究团队利用其跨膜表面糖蛋白(GP).以重组腺病毒为载体研发了埃博拉疫苗.腺病毒是一种DNA病毒.腺病毒载体包括骨架质粒(携带腺病毒的主要功能基因)和穿梭质粒(能转移外源基因到骨架质粒上).下图为重组埃博拉疫苗制作的部分流� 题目和参考答案——青夏教育精英家教网—

题目内容

【题目】引起人类产生埃博拉出血热的埃博拉病毒（EBOV），是一种单链RNA病毒，某研究团队利用其跨膜表面糖蛋白（GP），以重组腺病毒为载体研发了埃博拉疫苗。腺病毒是一种DNA病毒，腺病毒载体包括骨架质粒（携带腺病毒的主要功能基因）和穿梭质粒（能转移外源基因到骨架质粒上）。下图为重组埃博拉疫苗制作的部分流程示意图，已知四种限制性核酸内切酶KpnI、BamHI、NheI、BgIII的识别序列和酶切位点分别为：。请回答下列问题：

（1）为了判断是否感染EBOV，利用探针对疑似患者进行核酸检测，其检测方法采用了______技术。为了提高检测的准确性，需从EBOV核酸中选取具有______的序列作为探针设计的模板。

（2）从EBOV基因组中分离出的GP基因不能直接与穿梭质粒重组，其原因是______；而过程①获得的GP基因片段因两端缺乏______也不能直接与穿梭质粒重组。研究人员在过程①获得的GP基因片段下游添加了含“-AGATCT-”的序列，则需在其上游添加包含有______序列的片段，以便与穿梭质粒重组，且能避免GP基因反向连接。

（3）实际操作中需利用限制酶将环状的重组穿梭质粒切成两个核苷酸片段，则切割前后含有的游离磷酸基团数目变化为______。将含GP基因的核苷酸片段与骨架质粒通过过程④完成重组，再在含______的平板上培养，筛选出含重组骨架质粒的阳性菌。

（4）过程⑤中，利用脂质体将重组骨架质粒导入到人的胚胎肾细胞HEK293中，其运用的原理是______，再将成功导入的细胞HK293培养一段时间，获得大量重组腺病毒，为疫苗的进一步研究奠定基础。

【答案】分子杂交特异性 GP基因是单链RNA结构相应的限制酶酶切位点（或相应的限制酶识别序列） -GGTACC- 0→4 卡那霉素膜的流动性

【解析】

基因工程是狭义的遗传工程，基因工程的基本原理是让人们感兴趣的基因（即目的基因）在宿主细胞中稳定高效地表达。为了实现基因工程的目标，通常要有多种工具酶、目的基因、载体和宿主细胞等基本要素，并按照一定的程序进行操作，它包括目的基因的获得、重组DNA的形成，重组DNA导入受体细胞也称（宿主）细胞、筛选含有目的基因的受体细胞和目的基因的表达等几个方面。基因表达载体的构建（即目的基因与运载体结合）是实施基因工程的第二步，也是基因工程的核心。

（1）为了判断是否感染EBOV，利用探针（能与病毒的互补配对的序列）对疑似患者进行核酸检测，其检测方法采用了分子杂交技术（碱基互补配对）。为了提高检测的准确性，需从EBOV核酸中选取具有特异性的序列作为探针设计的模板。

（2）EBOV是RNA病毒，从EBOV基因组中分离出的GP基因是单链RNA结构，不能直接与穿梭质粒重组，且过程①获得的GP基因片段因两端缺乏相应的限制酶酶切位点（或相应的限制酶识别序列）也不能直接与穿梭质粒重组。质粒与目的基因相连，需要有相同的粘性末端，因此需要在目的基因两端添加酶切位点，从图中可知质粒的启动子和终止子之间有三种酶切位点（KpnI、BamHI、BgIII），“-AGATCT-”的序列是BgIII的识别位点，若用BamHI来酶切，会得到相同的粘性末端，因此只能用KpnI来酶切质粒，则需在GP基因上游添加包含有-GGTACC-序列的片段，且能避免GP基因反向连接。

（3）实际操作中需利用限制酶将环状的重组穿梭质粒切成两个核苷酸片段，有两个酶切位点，一个酶切位点会比切割前多出来2个游离的磷酸基团，则切割前后含有的游离磷酸基团数目变化为0→4。将含GP基因的核苷酸片段与骨架质粒通过过程④完成重组，重组质粒含卡那霉素抗性基因，因此需在含卡那霉素的平板上培养，筛选出含重组骨架质粒的阳性菌。

（4）脂质体(空心)是由卵磷脂和神经酰胺等制得的双分子层结构，过程⑤中，利用脂质体将重组骨架质粒导入到人的胚胎肾细胞HEK293中，其运用的原理是膜的流动性（相似相溶）。