Question

4．β-半乳糖甘酶是一种能够将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖的酶，经β-半乳糖甘酶处理过的奶制品可供乳糖不耐症患者安全食用．某科研机构为了研发一种比天然酶活性更高的新型β-半乳糖甘酶，从预期新型β-半乳糖甘酶的氨基酸序列出发，推测相应的脱氧核苷酸序列，并人工合成了两条80个碱基的DNA单链，两条链通过16个碱基
对形成部分双链DNA片段，再利用K酶补平，获得双链DNA，过程如图1．

分析回答下列问题：
（1）K酶是一种DNA聚合酶，合成的双链DNA有144个碱基对．
（2）在利用K酶得到少数双链DNA分子之后，需要经过PCR获得更多相同的DNA分子并在基因两端加上限制酶识别序列，以便构建基因表达载体．PCR的原理如图2所示．图中引物为单链DNA片段，它是子链合成延伸的基础．
①从理论上推测，第六轮循环产物中含有引物A的DNA片段所占的比例为$\frac{63}{64}$．
②在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段．
③设计引物是PCR技术的关键步骤之一．某同学设计的两组引物（只标注了部分碱基序列）都不合理（如图3），请分别说明理由．
第1组：引物Ⅰ和引物Ⅱ会发生局部碱基互补配对而失效；
第2组：两条引物Ⅱ之间会发生局部碱基互补配对而失效．
（3）某乳业公司欲获得含有β-半乳糖苷酶的奶源，研发人员设计了如图4所示的技术路线．图4中kan^R表示卡那霉素抗性基因，amp^R表示氨苄青霉素抗性基因，SmaI、EcoRV、EcoRI直线所示为三种限制酶的酶切位点．
①图4中将β-半乳糖苷酶基因插入载体，需用EcoRV和EcoRI（填限制酶名称）限制酶同时酶切载体和PCR产物，设计双酶切的目的是保证目的基因和载体的定向连接．
②筛选含有重组载体的大肠杆菌需要在含卡那霉素的培养基上进行．大肠杆菌是理想的受体细胞，这是因为它繁殖快、单细胞、遗传物质相对较少．
③过程a一般采用的操作技术是显微注射法．
④能使β-半乳糖苷酶基因在乳腺细胞中特异性表达的调控序列是A（填字母）．
A．启动子　　　　B．tet^R　　　　C．复制原点　　　　　D．amp^R
⑤为检测β-半乳糖苷酶基因是否转录出了探针与杂交，该杂交技术称为mRNA，可用标记的β-半乳糖苷酶基因片段作探针与mRNA
杂交，该杂交技术称为A（填字母）技术．
A．核酸分子杂交
B．基因序列分析
C．抗原一抗体杂交
D．PCR．

Answer 1

分析 1、基因工程的操作步骤：目的基因的获取、基因表达载体的构建、目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定．
2、PCR技术扩增目的基因
（1）原理：DNA双链复制
（2）过程：第一步：加热至90～95℃DNA解链；第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成．

解答 解：（1）根据题意可知，两条链通过16个碱基对形成部分双链DNA片段，再利用K酶补平，获得双链DNA，因此K酶是一种DNA聚合酶．由于双链部分含有16个碱基对，而人工合成了的DNA单链有两条80个碱基，因此两侧各剩余含有64个碱基组成的单链部分，则合成的双链DNA有64×2+16=144个碱基对．
（2）①在PCR技术扩增中，只有亲代DNA分子的一条母链上不存在引物A，因此扩增获得的所有子代DNA分子中只有一个DNA分子不含引物A．从理论上推测，经过六轮循环产生64个DNA分子，其中含有引物A的DNA片段所占的比例为$\frac{63}{64}$．
②图中看出，引物的结合位置均不在DNA链的端部，因此经过一次循环后产生的两个DNA分子都不等长；在第二次循环后形成的子链中出现固定长度的DNA链，但是形成的四个DNA分子都不等长；一直在第三轮循环产物中开始出现两条脱氧核苷酸链等长的DNA片段．
③第1组：分析图中引物可知，引物Ⅰ和引物Ⅱ的碱基之间存在互补配对关系，这可能会导致引物Ⅰ和引物Ⅱ会发生局部碱基互补配对而失效；
第2组：图中引物Ⅱ的两侧碱基具有碱基配对关系，因此两条引物Ⅱ之间会发生局部碱基互补配对而失效．
（3）某乳业公司欲获得含有β-半乳糖苷酶的奶源，研发人员设计了如图4所示的技术路线．图4中kan^R表示卡那霉素抗性基因，amp^R表示氨苄青霉素抗性基因，SmaI、EcoRV、EcoRI直线所示为三种限制酶的酶切位点．
①分析题图可知，图4中目的基因的两侧具有EcoRV、EcoRI两种限制酶的酶切位点，因此将β-半乳糖苷酶基因插入载体，需用EcoRV和EcoRI两种限制酶同时酶切载体和PCR产物，从而保证目的基因和载体的定向连接．
②amp^R表示氨苄青霉素抗性基因，图中看出，利用EcoRV和EcoRI两种限制酶酶切载体时，该抗性基因将失活，因此筛选含有重组载体的大肠杆菌需要在含卡那霉素的培养基上进行．大肠杆菌是理想的受体细胞，这是因为它繁殖快、单细胞、遗传物质相对较少．
③在将目的基因导入受体细胞时，如果受体细胞为受精卵时，一般采用显微注射法．
④能使β-半乳糖苷酶基因在乳腺细胞中特异性表达的调控序列是启动子．
⑤为检测β-半乳糖苷酶基因是否转录出了探针与杂交，该杂交技术称为mRNA，可用标记的β-半乳糖苷酶基因片段作探针与mRNA杂交，该杂交技术称为核酸分子杂交技术．
故答案为：
（1）DNA聚合    144
（2）①$\frac{63}{64}$ 
②三
③引物Ⅰ和引物Ⅱ会发生局部碱基互补配对而失效    两条引物Ⅱ之间会发生局部碱基互补配对而失效
（3）①EcoRV和EcoRI     保证目的基因和载体的定向连接
②卡那霉素    繁殖快、单细胞、遗传物质相对较少
③显微注射法
④A
⑤标记的β-半乳糖苷酶基因片段   mRNA    A

点评 本题综合考查了基因工程的有关知识，要求考生能够掌握基因工程的操作步骤和工具；能够提取题图中有效解题信息，具有一定的难度．