请分析回答下列有关基因工程问题：

Ι 基因工程是按人们预先设计的蓝图，将目的基因通过一定方法导入到另一种生物的细胞中，使之产生符合人类需要的新的遗传性状或创造出新的生物类型的现代技术。

57.基因工程常用的三种工具为限制性内切酶、　　　　　　 、质粒，通常选择质粒作为“目的基因的运输载体”是由于　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 。

58.基因工程一般包括四步：获取目的基因；目的基因与运载体重组；　　　　　　　 ；

　　　　　　　　　 　　。

Ⅱ 在基因工程中通常需要利用PCR技术扩增目的基因，其原理与细胞内DNA复制类似，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR如右图示，包括三个基本反应步骤：①模板DNA的变性：模板DNA经加 热至93℃左右一定时间后双链解离；②模板DNA与引 物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链结合形成DNA模板--引物结合物；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，合成一条新的与模板DNA 链互补的脱氧核苷酸链。重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得较多的目的基因。

59.温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链结合形成DNA模板--引物结合物时所遵循的原则是　　　　　　　　　　　　　　　　 。

60.在PCR技术中，引物的作用是　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 。

61.从理论上推测，第三轮循环产物中含有引物B的DNA片段所占比例为　　　　　　　　 。

62.下图表示利用PCR技术获取目的基因X的第一次循环产物。则至少需要在　　　 轮循环产物中才能开始出现独立且完整的的X基因。如果经过n次循环，则产物中①所示DNA分子数为　　　　　　 。

63.用限制酶EcoRV、MboI单独或联合切割同一种质粒，得到DNA片段长度如下图（1kb即1000个碱基对），请在答题卡的指定位置画出质粒上EcoRV、MboI的切割位点。

研究人员利用基因工程技术对肺癌的治疗进行了大量研究，肺部细胞中的let-7基因表达减弱，癌基因RAS表达增强，会引发肺癌。研究人员利用基因工程技术将let-7基因导入肺癌细胞实现表达，发现肺癌细胞的增殖受到抑制。该基因工程技术基本流程如图所示，据图回答

1.在基因工程中通常选择细菌质粒作为载体，原因是                          ；如果某质粒由100 0个脱氧核苷酸组成，脱氧核苷酸平均分子量为a,则该质粒的质量为        。

2.图甲中在构建重组载体时，酶切目的基因和酶切质粒时，所用的限制酶可以不同，但是产生的粘性末端必须是                。

3.图甲中在将酶切后的目的基因导入到酶切后的质粒上时需要的酶是              ， 图乙中let-7基因转录过程需要的酶是    ，这 两种酶作用的化学键都是          。

4.EcoR I限制酶只能识别序列一GAATTC一，并只能在G与A之间切割。若在某目的基因的两侧各有1个EcoR I的切点，请画出目的基因两侧被限制酶EcoR I切割后所形成的黏性末端。                      

5.原代培养是是指直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养。原代培养随着培养时间的延长和细胞不断分裂，空间因素和营养因素会限制其进一步生长。此时就需要将培养物分割成小的部分（组织细胞分散开），重新接种到另外的培养器皿内再进行培养，这个过程就称为传代或者再培养。图甲中进行传代培养操作时，需要用　　 　　酶处理贴附在原代培养培养皿壁上的细胞，以利于传代培养。

6.研究发现，let-7基因能影响RAS基因的表达，其影响机理如图乙所示。从分子水平的角度分析，其作用机理是　　                               　    　。

7.下图所示pBR322是目前常用的人工质粒载体。如果将BamHI处理后的pBR322质粒与用BgIⅡ处理得到的目的基因进行重组，并将重组质粒导入原本无amp^R和tet^R  的大肠杆菌进行培养。为了检测重组质粒是否成功导入大肠杆菌，现将上述大肠杆菌在含氨苄青霉素的培养基上培养，得到如图二的菌落。再将灭菌绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落，然后将绒布按到含四环素的培养基上培养，得到如图三的结果(空圈表示与图二对照无菌落的位置)。与图三空圈相对应的图二中的菌落表现型是___       _____ ，图三结果显示，多数大肠杆菌内导入的是___            __。