（10分）圆褐固氮菌是自生固氮菌，为经济有效地提高农作物产量，人们一直在努力研究、寻找固氮基因。对基因的研究常常因研究样品中DNA含量太低而难以进行，PCR技术有效地解决了这个问题。如今对基因的深入研究使人类跨入了蛋白组研究时代，从复杂的细胞混合物中提取、分离高纯度的蛋白质是该研究要做的基本工作之一。

（1）某同学在做微生物实验时，不小心把圆褐固氮菌样品和酵母菌样品混在一起，已知青霉素会影响固氮菌的生长繁殖，但不影响真菌的生长繁殖。请填空完成分离这两种菌的主要实验步骤：

①分别配置                的培养基和             的培养基，分别分成两份，依次标上A、a、B、b备用；

②分别向A、B培养基接种             ；

③把接种后的培养基放在恒温箱中3d—4d；

④从A、B培养基上生长的       中挑取生长良好的菌株，分别接种到        中；

⑤                                  。

（2）用基因工程技术从经过分离、提纯的圆褐固氮菌中获取固氮基因，然后进行PCR扩增。下列表1和表2分别表示用PCR扩增固氮基因的反应体系及反应条件。

①从上表中可得出，PCR技术与DNA复制相比较，主要区别之一是               。

此外，从反应条件看，所使用的DNA聚合酶应具有__________的特点。每次循环都需要2种引物的主要原因是_______________           ________________。

ch1L基因是蓝藻拟核DNA上与叶绿素合成有关的基因。为研究该基因对叶绿素合成的控制，需要构建该种生物缺失ch1L基因的变异株细胞。构建过程如下：

第①步：用PCR技术从蓝藻环状DNA中扩增出ch1L基因片段。

第②步：将ch1L基因与质粒构建形成重组质粒1。

第③步：将重组质粒1中ch1L基因中部0.8kb片段删除，用一段红霉素抗性基因取代之，得到重组质粒2。

第④步：将重组质粒2导入蓝藻细胞，由于改造后的基因与ch1L基因仍有很长的序列相同，所以能准确地与其发生同源重组，产生出缺失ch1L基因的突变株。请根据上述资料，回答下列问题：

（1）第①步用PCR技术扩增DNA片段时用到的耐高温的酶通常是指什么酶？           。

PCR扩增DNA时必须加入引物，其作用是                                         。

（2）利用PCR技术扩增DNA一般要经过三十多次循环，每次循环都要经过三个步骤，其中“复性”这一步骤发生的变化是                                          。

（3）构建重组质粒1、2时，为保证成功率，往往使用                                  酶对基 因和质粒进行切割，以切出相同的黏性末端，便于连接。此酶的作用是将DNA分子的               键打开。

（4）质粒是基因工程中最常用的运载体，其化学本质是                      ，此外还可用噬菌体、动植物病毒作用为运载体。

（5）导入重组质粒2以后，往往还需要进行检测和筛选，可用                   制成探针，检测是否导入了重组基因，在培养基中加入              可将变异株细胞筛选出来。

ch1L基因是蓝藻拟核DNA上与叶绿素合成有关的基因。为研究该基因对叶绿素合成的控制，需要构建该种生物缺失ch1L基因的变异株细胞。构建过程如下：

第①步：用PCR技术从蓝藻环状DNA中扩增出ch1L基因片段。

第②步：将ch1L基因与质粒构建形成重组质粒1。

第③步：将重组质粒1中ch1L基因中部0.8kb片段删除，用一段红霉素抗性基因取代之，得到重组质粒2。

第④步：将重组质粒2导入蓝藻细胞，由于改造后的基因与ch1L基因仍有很长的序列相同，所以能准确地与其发生同源重组，产生出缺失ch1L基因的突变株。请根据上述资料，回答下列问题：

（1）第①步用PCR技术扩增DNA片段时用到的耐高温的酶通常是指什么酶？         。

PCR扩增DNA时必须加入引物，引物的实质是          ，其作用是                                。

（2）利用PCR技术扩增DNA一般要经过三十多次循环，每次循环都要经过三个步骤，其中“复性”这一步骤发生的变化是                   。为消除PCR扩增过程当中外源DNA污染造成的影响，应如何设置对照？                       。

（3）构建重组质粒1、2时，为保证成功率，往往使用                        酶

对基因和质粒进行切割，以切出相同的黏性末端，便于连接。此酶的作用是将DNA分子的              键打开。

（4）质粒是基因工程中最常用的运载体，其化学本质是         ，此外还可用噬菌体、动植物病毒作用为运载体。

（5）导入重组质粒2以后，往往还需要进行检测和筛选，可用            制成探针，检测是否导入了重组基因，在培养基中加入              可将变异株细胞筛选出来。

（10分）ch1L基因是蓝藻拟核DNA上与叶绿素合成有关的基因。为研究该基因对叶绿素合成的控制，需要构建该种生物缺失ch1L基因的变异株细胞。构建过程如下：

第①步：用PCR技术从蓝藻环状DNA中扩增出ch1L基因片段。

第②步：将ch1L基因与质粒构建形成重组质粒1。

第③步：将重组质粒1中ch1L基因中部0.8kb片段删除，用一段红霉素抗性基因取代之，得到重组质粒2。

第④步：将重组质粒2导入蓝藻细胞，由于改造后的基因与ch1L基因仍有很长的序列相同，所以能准确地与其发生同源重组，产生出缺失ch1L基因的突变株。请根据上述资料，回答下列问题：

（1）第①步用PCR技术扩增DNA片段时用到的耐高温的酶通常是指什么酶？         。

PCR扩增DNA时必须加入引物，引物的实质是          ，其作用是                                。

（2）利用PCR技术扩增DNA一般要经过三十多次循环，每次循环都要经过三个步骤，其中“复性”这一步骤发生的变化是                   。为消除PCR扩增过程当中外源DNA污染造成的影响，应如何设置对照？                       。

（3）构建重组质粒1、2时，为保证成功率，往往使用                        酶

对基因和质粒进行切割，以切出相同的黏性末端，便于连接。此酶的作用是将DNA分子的              键打开。

（4）质粒是基因工程中最常用的运载体，其化学本质是         ，此外还可用噬菌体、动植物病毒作用为运载体。

（5）导入重组质粒2以后，往往还需要进行检测和筛选，可用            制成探针，检测是否导入了重组基因，在培养基中加入              可将变异株细胞筛选出来。

2．(17分)(2012·南昌一模)尿素是一种重要的农业肥料，需经细菌的分解才能更好地被植物利用。生活在土壤中的微生物种类和数量繁多，下列是从土壤中分离分解尿素细菌的有关问题，请分析回答：

(1)如图是利用________法进行微生物接种，把聚集的菌种逐步________到培养基的表面。除此方法外，常用的微生物接种方法还有________(写一种)。

(2)如果要对培养的菌落进行纯化，在培养基上划线操作中，操作的第一步及每次划线之前都要灼烧接种环，目的是对接种环进行________，灼烧的接种环冷却后才能接种的原因是______________________。

(3)下面是两种培养基的配方：

表1：A培养基配方

表2：B培养基配方

①配制培养基的操作步骤________(用字母顺序回答)。

a．倒平板　b．计算　c．溶化　d．称量　e．灭菌

②通常培养基采用____________法灭菌，在制备固体培养基的倒平板操作时，平板冷凝后，应将平板倒置，目的是________________________。

③如果要分离土壤中能分解尿素的细菌，应选择上述________(A、B)配方的培养基，在该培养基中加入________指示剂，可初步鉴定出该种细菌能否分解尿素。

④据B培养基的成分，所培养微生物的同化作用类型是________。

(4)如果进一步从尿素分解菌中提取出DNA，利用PCR技术扩增，则每次循环复制可分为________________三步。而尿素分解菌能分解尿素的直接原因是它们能合成________，该物质被提取出后的纯化方法通常是____________________________________________________。

(5)在微生物培养过程中，常需要对微生物进行计数，血球计数板是常用的工具，血球计数板的计数室长和宽各为1 mm，深度为0.1 mm，其中25×16型的血球计数板计数室以双线等分成25个中方格，每个中方格又分成16个小方格。一般计数时选取的中方格位于计数室的____________________。下图表示的是其中一个中方格的情况，对该中方格中的酵母菌进行计数的结果是________个。如果计数的几个中方格中的细胞平均数为20个，则1 mL培养液中酵母菌的总数为________个。

(6)抗生素可由微生物产生，具有抑菌作用，能在琼脂培养基中扩散。在筛选产生抗生素的菌种时，先在琼脂培养基平板上划线接种一种从土壤中获得的甲菌，在27 ℃下培养3天，形成菌落。然后接种乙、丙、丁三种致病菌(图A)，继续在同样条件下培养3天，结果如图B。分析结果，得出的结论是(　　)

①甲菌产生了抗生素　②丁菌的生长被丙菌产生的抗生素抑制　③乙菌的生长被甲菌产生的抗生素抑制　④丙菌产生的抗生素抑制了乙菌的生长

A．①③　　　　　　B．①④

C．②③　　　　　　D．②④